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常见问题

荧光定量pcr常见问题的可能原因与解决方案

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-08-24

    一、无Ct值或Ct值延迟出现:扩增曲线信号不佳,曲线不平滑:标准曲线线性差。

    1.扩增产物大小不合适:实时荧光定量PCR扩增片段的长度通常在80-150 bp之间,如果调整反应的时间有可能扩增500bp的片段。

    2.PCR反应过程中退火及延伸的时间过短或过长:应根据扩增片段的大小予与调整。

    3.MgCl,浓度不合适:按0. 5mm的间距调整MgCI2的浓度。

    4.循环数设置不足:最少设置35个循环,可以增加到45个循环。超过45个循环以上背景信号会增加,对实验结果的分析造成干扰。

    5.在错误的PCR反应步骤采集信号:应检查程序设置确保信号的采集是在退火的步骤进行的。

    6.加样的误差及错误:注意每次加样的一致性及移液器的校正。

    7.DNA模板的起始浓度过低,不能被检测出来:如果模板的浓度未知,最初的实验可以采用较高浓度的模板并进行梯度稀释。最高的模板浓度不超过500ng基因组DNA。

    8.模板DNA的降解:使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA模板是否降解,检查DNA模板的储存条件是否合适,如果确认降解应重新制备新鲜的DNA模板。

    9.梯度稀释标准样品的方法不规范:应注意梯度稀释样品的操作规范,准确。

    10.引物或探针设计有误,存在二级结构:通过琼脂糖凝胶电泳检测荧光定量PCR反应结果,是否有PCR产物存在。如果没有PCR扩增产品,应使用引物设计软件检查引物的各种指标是否合适: Tm. 与模板的批配度、 二级结构、扩增片段的长度、非特异型扩增的情况。具体的数据请翻阅前面的相关原理说明

    11.引物之间的Tm值相差过多:上下游引物的Tm值差不应超过4C。

    12.引物或探针的使用浓度不合适:应将浓度控制在50- 900 nM之间,探针的浓度低于引物的浓度。

    13.引物或探针降解:使用琼脂糖凝胶电泳检测DNA模板是否降解,检查DNA模板的储存条件是否合适,如果确认降解应重新制备新鲜的DNA模板。

    14.探针设计的位置在扩增片段的5’端:应将探针设计的位置靠近扩增片段的3”端

    15.探针被氧化:避免用酸性溶液溶解探针,否则会产生高背景荧光信号及低的扩增信号。推荐的缓冲液是pH8.0的TE缓冲液中。

    二、阴性对照有扩增信号(不含有模板)

    1.反应环境中残留有之前实验的DNA或PCR产物:实验前清洁实验区及实验仪器避免DNA分子的残留。必要时可以使用UDG酶的方法去除残留的DNA分子

    2.阴性对照体系一般会在35个循环后检测到明显的荧光信号,如果过早出 现荧光信号说明有引物二聚体存在。通过融解曲线的分析.在50-60°C度出现峰值。电泳检测无明显的DNA产物出现。

    三、融解曲线存在非单一峰

    1.存在非特异性扩增:检查各种组分的浓度是否在正常的范围。引物及探针的设计是否合理。前文关于引物及探针一栏有详细的说明

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