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常见问题

带你了解PCR基因检测核心技术发展历史

作者:基因谷   发布时间:2020-07-04

    PCR(Polymerase Chain Reaction),即“聚合酶链式反应”,是为了解决在体外特异性地扩增某个基因的问题,从而满足对核酸的体外研究和应用。PCR基因检测核心技术是怎么样呢?

    1953-DNA结构基础

    沃森和克里克发表的DNA双螺旋结构模型标志着分子生物学的诞生,这一成果也被誉为20世纪以来生物学方面最伟大的发现[1]。自此,人类一直在探索研究DNA的新方法,新技术。
        DNA结构基础
    DNA结构基础

    1971-PCR技术雏形

    Khorana第一个成功完成基因的合成—丙氨酸tRNA编码基因[2];Kleppe提出体外扩增设想[3]。但由于当时的技术水平有限,并且具有较强稳定性的DNA聚合酶还未被发现,DNA体外扩增技术并未获得全面推广。

    1985-PCR技术首次提出

    Mullis阐述了具有划时代意义的PCR技术[4]。其原理类似于DNA的体内复制,只是在试管中提供体外合成合适的条件---模版DNA,寡核苷酸引物,dNTP,DNA聚合酶,合适的缓冲体系,DNA变性、复性及延伸的温度与时间。最初使用的大肠杆菌DNA聚合酶Klenow片段不耐热,每次加热变性DNA后都要重新补加。耗时、费力、易出错。
    pcr试剂

    1988-PCR技术的优化

    Saiki等在黄石公园温泉中分离的一株水生嗜热杆菌(thermus aquaticus, Taq) 中提取到一种耐高温DNA聚合酶[5]。该酶耐高温的性质使其热变性时不会被钝化,不必在每次扩增反应后再加新酶,从而极大地提高了PCR扩增的效率。Taq酶的发现,使得PCR真正变为现实,为其自动化铺平了道路。

    1989-PCR爆炸年

    美国《Science》杂志列PCR为十余项重大科学发明之首,将热稳定DNA聚合酶命名为“年度分子”。

    1993-诺贝尔奖

    凯利•穆利斯(Kary Banks Mullis)博士因PCR技术荣获诺贝尔化学奖。

    PCR技术原理

    一个PCR循环包括变性-退火-延伸:

    首先高温加热变性解链DNA模板;随之将反应混合物冷却至某一温度,这一温度可使引物与它的靶序列发生退火;再将温度升高使退火引物在DNA聚合酶作用下得以延伸。

    不断重复此循环,短短数十分钟就可把目标DNA进行2n指数倍扩增。
    PCR反应示意图

    PCR反应示意图

    PCR技术应用

    PCR以其高灵敏度、高效率扩增目标DNA的特点,广泛应用于生命科学、医疗诊断、pcr基因检测、食品卫生和环境检测等方面。
    PCR技术应用

    伴随人类对于基因信息的探索,以PCR为核心的基因检测技术得到了空前的发展:根据检测目的和检测特性不同,PCR技术逐渐细分出二代PCR技术(半定量检测)及三代PCR技术(绝对定量检测)。与此同时,一代DNA测序技术(读长长、准确度高、通量低)和二代DNA测序技术(读长短、通量高)也相继被发明并被人们广泛使用。从下期开始,GeneThinkTank 将带领大家进入探索基因检测技术的旅程,从零开始了解这几类重要的基因检测技术。

    文章中涉及图片部分来源于参考文献和网络,版权归原作者所有,若有不妥,请联系删除。

    参考文献

    [1] Watson, J. D. and F. H. Crick (1953). "Molecular structure of nucleic acids; a structure for deoxyribose nucleic acid." Nature 171(4356): 737-738.

    [2] Khorana, H. G. (1971). "Total synthesis of the gene for an alanine transfer ribonucleic acid from yeast." Pure Appl Chem 25(1): 91-118.

    [3] Kleppe, K., et al. (1971). “Study on polynucleotides: repair replication of short synthetic DNA’s as catalyzed by DNA polymerases.” J Mol Biol 56(2): 341-361.

    [4] Saiki, R. K., et al. (1985). "Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analysis for diagnosis of sickle cell anemia." Science 230(4732): 1350-1354.

    [5] Saiki, R. K., et al. (1988). "Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase." Science 239(4839): 487-491.

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