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常见问题

实时荧光定量PCR:荧光探针和荧光染料简介

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-06-22

    根据所使用的技术不同,实时荧光定量PCR可以分为:荧光探针和荧光染料两种方法。现将其原理简述如下:

    1. TaqMan荧光探针

    TaqMan探针法是高度特异的定量PCR技术,其核心是利用Taq酶的3'→5'外切核酸酶活性,切断探针,产生荧光信号。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针,该探针为一寡核苷酸,两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时,报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收;PCR扩增时,Taq酶的3'→5'外切酶活性将探针酶切降解,使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离,从而荧光监测系统可接收到荧光信号,即每扩增一条DNA链,就有一个荧光分子形成,实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析,又可分析基因突变(SNP),有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。

    2. SYBR荧光染料

    在PCR反应体系中,加入过量SYBR荧光染料,SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后,发射荧光信号,而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号,从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。SYBR仅与双链DNA进行结合,因此可以通过溶解曲线,确定PCR反应是否特异。SYBR荧光染料法定量PCR的基本过程是:

    ① 开始反应,当SYBR染料与DNA双链结合时发出荧光;

    ② DNA变性时,SYBR染料释放出来,荧光急剧减少;

    ③ 在聚合延伸过程中,引物退火并形成PCR引物;

    ④ 聚合完成后,SYBR染料与双链产物结合,定量PCR系统检测到荧光的净增量加大。

    实时荧光定量PCR技术根据化学原理可以分为探针类和非探针类。探针类实时荧光定量 PCR 技术主要是利用与靶序列特异杂 交的探针来指示扩增产物的增加;非探针类实时荧光定量 PCR 技 术主要通过荧光染料来指示产物的增加。无论是探针类实时荧光 定量 PCR 技术还是非探针类实时荧光定量 PCR 技术,检测的都是 扩增产物的增加量。但探针类实时荧光定量 PCR 技术增加了识别 探针的具体的流程,操作的难度较大。

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