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常见问题

恒温扩增分子检测法与核酸扩增法对肺结核诊断价值的比较

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-05-26

    目的比较交叉引物扩增(CPA)、恒温核酸扩增荧光检测(RealAmp)法与利福平耐药实时荧光定量核酸扩增(Xpert MTB/RIF)法对肺结核诊断的效果,评估CPA和RealAmp法在基层医院推广的价值。方法收集2014年10月至2015年lO月河南省中牟县疾病预防控制中心、新密市和邓卅l市结核病防治所疑诊肺结核患者3 193例,其中男2 183例,女1 010例,年龄15——86岁,平均55岁。按照中华医学会结核病学分会制定的“肺结核诊断和治疗指南”标准诊断,确诊肺结核患者1 383例,非结核病患者1 810例。收集3份痰标本,优先选用晨痰,当无晨痰时可选择夜间痰。对3 193份痰标本涂片染色镜检,行抗酸染色及固体罗氏培养基培养,同时行CPA、RealAmp和XpertMTB/RIF法检测。对培养阳性的菌株进行MPB64抗体测定及初步菌种鉴定。以菌种鉴定后的培养结果和临床诊断结果为对照,比较CPA、RealAmp和Xpert MTB/RIF检测MTB的敏感度和特异度。结果与固体培养结果比较,CPA、RealAmp和Xpert MTB/RIF法检测的敏感度分别为85.5%(413/483例)、85.5%(413/483例)和87.9%(422/480例),三者比较差异无统计学意义(x2=1.6,P>0.05);CPA、RealAmp和Xpert MTB/RIF法的特异度分别为96.8%(2 624/2 170例)、93.2%(2 527/2 170例)和95.3%(2 567/2 170例),三者比较差异有统计学意义(x2=37.8,P<0.001)。与临床诊断结果对比,涂片镜检、固体培养、CPA、RealAmp和Xpert MTB/RIF检测MTB的敏感度分别为21.7%(300/1 383例)、34.9%(483/1 383例)、34.6%(478/1 383例)、39.2%(542/1 383例)和38.1%(526/1 381例),3种分子检测法的敏感度高于涂片镜检(x2=31.9,P<0.01),但3种方法问的敏感度比较差异无统计学意义(X2=2.9,P>0.05)。与临床诊断结果比较,涂片镜检、固体培养、CPA、RealAmp和Xpen MTB/RIF法的特异度分别为100%(1 810/1 810例)、100%(1 810/1 810例)、98.8%(1 89/1 8lo例)、98.8%(1 756/1 810例)和97.0%(1 788/1 810例),3种分子检测方法间的特异度比较差异无统计学意义(X2=0.16,P>0.05)。结论CPA、RealAmp与XpertMTB/RIF检测痰标本的敏感度和特异度相似,但CPA与RealAmp检测快速、简便,更适于基层实验室对肺结核的诊断。
    我国是全球30个结核病高负担国家之一,位居全球第3位,每年新发结核病患者约90万例。1 o。目前我国基层结核病实验室常用的涂片显微镜检查敏感度较低,固体培养敏感度高但所需时间长(3——8周)。全国结核病“十三五”防治规划中明确提出肺结核患者病原学阳性的诊断率达到50%以上,尽快提升结核病实验室的检测能力,特别是基层实验室的能力是亟需解决的问题之一。随着分子生物学技术的发展,近年来涌现出许多快速诊断结核病的方法,其中利福平耐药实时荧光定量核酸扩增(XpertMTB/RIF)法是其中之一,该方法使用全自动、定量、半巢式实时荧光PCR检测系统,敏感度和特异度较高,可快速报告MTB和利福平的耐药结果。2圳,是世界卫生组织推荐用于肺结核快速诊断的分子检测方法,但因设备和试剂昂贵、维护成本高及实验室信息安全等原因,限制了在我国基层单位的广泛应用。MTB交叉引物扩增(cross—priming amplification,CPA)是一种恒温核酸扩增技术,将核酸扩增、杂交和试纸条检测3种技术有机地融为一体,在63℃扩
    增反应体系中加入2对MTB特异性引物和2条特异性探针,一次性完成核酸的扩增及杂交过程,再用防污染核酸快速检测装置对MTB感染进行定性诊断,操作过程简单方便‘5。7 o。环介导恒温扩增技术(100p—mediated isothermal amplification,LAMP)是Notomi等‘8 o于2000年首先报道的恒温核酸扩增技术,可快速、高效、高特异地扩增目标靶序列。9。11I。恒温荧光检测技术(Real time LAMP,RealAmp)应用LAMP检测技术,在63℃恒温条件下扩增靶标核酸,通过使用荧光检测仪器观察有无s形扩增曲线来自动判读结果,操作简单方便,2 h内即可获得结果。本研究比较CPA、RealAmp与Xpert MTB/RIF诊断结核病的价值,评估2种恒温扩增方法在基层单位的应用前景。
    对象与方法
    一、对象
    纳入河南省中牟县疾病预防控制中心、邓州和新密市结核病防治所3个县级单位2014年10月1日至2015年10月31日就诊的可疑初治肺结核患者,共纳入3 220例,排除2例培养污染和25例经鉴定为感染非结核分枝杆菌患者,对剩余的3 193例进行比较分析,其中男2 183例,女1 010例,年龄15——86岁,平均55岁。按照“肺结核诊断和治疗指南”¨21标准诊断,确诊肺结核病患者1 383例,非结核病患者1 810例。
    二、仪器与试剂
    Xpert MTB/RIF实时荧光PCR检测仪(美国赛沛公司),恒温荧光检测仪(Deaou一308C,广州迪澳生物科技有限公司)。抗酸染色试剂(珠海贝索生物有限公司,批号:413081),酸性罗氏培养基(珠海贝索生物有限公司,批号:20140517),CPA检测试剂盒(杭州优思达生物技术有限公司,批号:20141103),RealAmp检测试剂盒(广州迪澳生物科技有限公司,批号20140801),MTB/RIF检测试剂盒(美国Cepheid公司,批号:15106)。
    三、研究方法
    1.实验室检测流程:收集3份痰标本,优先选用晨痰,当无晨痰时可选择夜间痰进行涂片染色镜检,再进行固体培养、CPA、RealAmp与Xpert MTB/RIF检测,痰标本按照固体培养前处理流程进行消化处理,保证终体积>14 ml,酸性罗氏培养每管接种0.1 ml处理液。前处理液每管分装至1——1.5 ml离心管中,取3管分别完成CPA、RealAmp和XpertMTB/RIF检测。剩余前处理液一20 cC冻存,以防培养污染或恒温扩增检测失败时使用。
    2.涂片镜检:采用萋一尼氏染色法对痰标本直接涂片镜检,操作方法参照《中国结核病防治规划一痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》o J3]中的标准化操作程序。
    3.分离培养:简单法同体培养试验按照《分枝杆菌分离培养标准化操作程序及质量保证手册》。14 o中的操作程序进行,优先选取晨痰和夜间痰,每份痰标本培养2管,共4管。
    4.Xpert MTB/RIF检测:取1 ml痰标本消化液,加入1 ml的Xpert MTB/RIF消化液,振荡30 S,静置15 min,将2 ml消化液加入Xpert MTB/RIF反应试剂盒中,然后将其放入4通道Xpert MTB/RIF平台中自动运行,2 h后查看系统显示的结果。
    5.CPA检测:用痰标本消化液提取MTB的DNA,以提取的DNA为模板,用CPA试剂盒进行核酸叵温扩增,具体操作参照试剂盒说明书。结果判读:若检测线和质控线同时出现,判为阳性;若仅出现质控线,判为阴性;若质控线和检测线均未出现,结果无效。
    6.RealAmp检测:用痰标本消化液提取DNA后,用恒温荧光检测仪扩增45 min,温度为63℃。结果判读:若有S形扩增曲线,则判断为阳性(含MTB);若无S形扩增曲线,则判为阴性(不含MTB)。
    7.菌种初步鉴定:对痰标本分离培养的阳性菌株进行MPB64分泌蛋白检测¨5|,按照MTB抗原检测试剂(杭')l'lgd新生物检控技术公司)说明书进行。
    四、质量控制3个地区的结核病实验室痰检质量由河南省结核病参比实验室控制,质控结果符合《痰涂片镜检标准化操作及质量保证手册》要求,且痰分离培养年污染率<5%,涂阳培阴率<10%。
    五、统计学方法
    采用SPSS 19.0统计软件进行统计学分析。分别以鉴定后培养结果和临床诊断结果为对照计算CPA、RealAmp和Xpert MTB/RIF检测的敏感度和特异度;采用x2检验(SPSS Statistics 19.0软件)对不同检测方法进行比较,以P<0.05为差异有统计学意义。
    结果
    一、与固体培养方法比较3种方法的检测效能
    固体培养结果阳性的483例中,采用CPA、RealAmp和Xpert MTB/RIF检测的敏感度分别为85.5%(413/483例)、85.5%(413/483例)和87.9%(422/481例,Xpert MTB/RIF检测报错误2例),3种检测方法的敏感度比较差异无统计学意义(x2=1.6,P>0.05)。培养阴性的2 710株中,CPA、RealAmp和Xpen MTB/RIF检测的特异度分别为96.8%(2 624/2 170例)、93.2%(2 527/2 170例)和95.3%(2 567/2 170例),3种检测方法的特异度比较差异有统计学意义(x2=37.8,P<0.001)。见表1。
    涂阳培阳患者282例,CPA检测阳性269例(95.4%),RealAmp检测阳性267例(94.7%),Xpert MTB/RIF检测阳性272例(97.1%),三者阳性率比较差异无统计学意义(x2 i---2.2,P>0.05)。涂阴培阳患者201例,CPA检测阳性144例(71.6%),RealAmp检测阳性146例(72.6%),xpen MTB/RIF检测阳性150例(75.0%),三者阳性率比较差异无统计学意义()(2=0.6,P>0。05)。涂阳培阴患者18例,CPA检测阳性13例,RealAmp检测阳性14例,Xpert MTB/RIF检测阳性13例,三者阳性率比较差异无统计学意义(X2=0.19,P>0.05)。
    二、3种方法对临床确诊病例的诊断效能
    临床确诊的1 383例肺结核患者中,涂片镜检、固体培养及CPA、RealAmp和Xpert MTB/RIF检测的敏感度分别为21.7%(300/1 383例)、34.9%(483/1 383例)、34.6%(478/1 383例)、39.2%(542/1 383例)和38.1%(526/1 381例)。3种分子检测法的敏感度显著高于涂片镜检(x2=31.9,P<0.01),但三者间比较差异无统计学意义(x2=2.9,P>0.05)。临床诊断为非结核的1 810例中,涂片镜检、固体培养、CPA、RealAmp和xpert MTB/RIF的特异度分别为100%(1 810/1 810例)、100%(1 810/1 8lO例)、98.8%(1 789/1 810例)、98.8%(1 756/1 810例)和97.0%(1 788/1 810例),见表2。3种分子检测方法特异度比较差异无统计学意义(×2=0.16,P>0.05)。
    三、3种检测方法与固体培养结果的一致性
    培养阴性、CPA检测阳性的86例中,临床确诊为肺结核的70例(81.4%);培养阴性、RealAmp检测阳性的183例中,临床确诊为肺结核的136例(74.3%);培养阴性、Xpert MTB/RIF检测阳性的126例中,临床确诊为肺结核的11 1例(88.1%)。3种分子检测方法结果均为阳性的71例,临床均确诊为肺结核(100%);CPA和RealAmp检测结果均为阳性者9例,其中8例临床确诊断为肺结核;CPA和Xpert MTB/RIF检测均为阳性者2例,临床均确诊为肺结核;RealAmp和Xpert MTB/RIF检测均为阳性的30例中24例临床确诊为肺结核。固体培养阳性但CPA检测阴性的70例中,57例(81.4%)涂片阴性且培养菌落生长数目较少(<20个);固体培养阳性而RealAmp检测阴性的70例中,55例(78.6%)涂片阴性且培养菌落生长数目较少(<20个);固体培养阳性而Xpert MTB/RIF检测阴性的58例中,50例(86.2%)涂片阴性且培养菌落生长数目较少(<20个)。
    讨论
    目前,尽管涂片和痰培养检测MTB具有许多缺点,但涂片价格低廉且操作方便,固体培养可提供后续的药敏试验菌株并进行分子流行病学分析,故仍作为常规方法使用。核酸恒温扩增技术的出现,使得分子生物学检测技术不需要昂贵的扩增仪器也可以进行,反应所需时间可控制在1 h左右,已逐渐成为基层结核病实验室对传统方法的补充,有时可替代传统方法。文献报道,以BacT/Alert3I)检测结果为金标准,CPA检测的敏感度和特异度达到92.8%(90/97)和98.8%(82/83)‘7 o;而在基础实验室多中心评估中CPA检测的敏感度和特异度为84.1%和97.8%116j,这与本研究结果一致(85.5%和96.8%)。欧喜超等¨刊发现,与临床诊断结果比较,RealAmp检测的敏感度为39.5%,高于涂片镜检的17.2%,与液体培养的敏感度39.7%基本相当。本研究中,与临床诊断结果比较,RealAmp检测的敏感度为39.2%,与文献报道结果一致。17。;CPA和XpertMTB/RIF检测敏感度分别为34.6%和38.1%,三者比较差异无统计学意义(x2=2.9,P>0.05)。Xpert MTB/RIF法因其自动化程度高、操作简便且可快速发现结核病患者和对利福平耐药物的结核病患者,因此世界卫生组织推荐用于结核病的诊断。本研究中Xpert MTB/RIF检测涂阳培阳患者的阳性率为97.1%,涂阴培阳患者的阳性率为75.0%,与文献报道结果(涂阳培阳为94.1%一100%,平均值为97。1%;涂阴培阳为57.1%——88.8%,平均值为69.5%)一致。1S-22]。与固体培养结果比较,CPA、RealAmp与Xpert MTB/RIF检测的敏感度分别为85.5%、85.5%和87.9%,CPA和RealAmp检测的敏感度与Xpert MTB/RIF比较差异无统计学意义(x2=1.6,P>0.05),这表明对于肺结核的诊断,CPA和RealAmp具有与Xpert MTB/RIF相当的效能。在患病率稳定的情况下,检测的特异度越低,则阳性预测值越低,无论是与固体培养法比较还是与临床诊断比较,三者的阳性预测值均印证了这一结论。进一步对培养阴性、3种分子检测方法检测阳性的结果进行分析,发现RealAmp法的假阳性54例,Xpert MTB/RIF 22例,CPA 21例,RealAmp检测的假阳性例数最多,可能与RealAmp结果判读标准的临界阈值设定有关,特别是检测结果处于临界值附近时,设定过低,则可能出现假阴性,过高则可能出现假阳性;也可能是RealAmp扩增效率高易发生非特异性扩增所致,还需要进一步研究ⅢJ。进行分子检测时,控制污染是最重要的,而基层实验室条件比较简陋,实验人员的技术能力相对较低,控制和处理污染的能力较弱,需要选配低污染风险的检测方法。本研究中的3个实验室均未出现污染现象。2种恒温方法在DNA提取过程中的液化、离心、洗涤等环节是在开放环境中进行,容易出现污染,随后的DNA扩增和扩增物检测及结果判读均在密闭环境中进行,降低了污染率;而Xpert MTB/RIF除第1步痰标本液化外,其他步骤均在密闭体系内完成,污染率相比恒温方法大大降低。目前,一种新型的无仪器核酸快速提取装置正在开发,该装置应用注射器将经前处理的标本核酸裂解,通过抽吸将裂解的核酸附着在装置内的核酸亲和膜上,再用清洗液将膜上杂质和抑制物去除,最后用洗脱液将核酸从膜上洗脱下来,制备成扩增模板,这种装置用于恒温扩增分子检测将减少交叉污染风险的出现。总之,本研究结果显示,CPA和RealAmp法具有与Xpert MTB/RIF法相当的检测能力,可简便、快速检测痰标本中的MTB,适于基层实验室对肺结核的诊断。

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