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常见问题

荧光定量PCR检测常见问题与解答

作者:荧光定量PCR仪   发布时间:2020-05-20

    Q:qRT-PCR技术的原理及应用?

    实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR)/qRT-PCR,是指在PCR反应体系中加入荧光标记物,利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程,最后通过扩增曲线对未知模板进行定量分析的方法。一般用于mRNA转录水平的定量研究、不同样本或基因组中DNA拷贝数的测定、基因芯片结果验证、药效分析等。

    Q:qRT-PCR检测对样品有何要求?

    取材后新鲜组织须于-80℃保存,干冰运输。动物组织>100mg,细胞数>106,植物组织>0.5g、幼嫩组织为宜,预计可以检测4个指标,避免反复冻融。当检测基因数较多时样品量须随之增加。

    Q:Real-time同电泳检测产物的PCR有何优势?

    Real-time qPCR通过荧光信号在每个反应循环终点检测,反应指数增长期,可以真实监测模板起始量,线性范围可达5——7个数量级;而终点法重复性不佳、线性范围较窄,且产物电泳检测受限于片段大小和凝胶分辨率、胶染料灵敏度等因素,线性范围在100-fold左右。

    Q:染料法与探针有何区别及优劣势?

    染料法以SYBR Green荧光强度的大小为指标来检测DNA的扩增,不需探针法中设计合成荧光标记探针,因此染料法实验周期及成本都得以降低。染料法可能会检测出引物二聚体等非特异扩增产物,需要通过进行融解曲线分析来确认反应产物是否特异性扩增,同时在引物设计及反应条件方面都需注意优化。探针法相对较易保证反应特性,但在检测灵敏度方面同染料法并无高低之分。金开瑞默认使用染料法。

    Q:相对定量和绝对定量分别指什么?

    相对定量用于测定实验组样本中目的序列拷贝数相对于对照组样本中目的序列拷贝数的变化倍数,比较各组样本间的Ct值;

    绝对定量测定待测样本中目的序列拷贝数的数量,需要通过标准品绘制标准曲线。

    Q:microRNA检测的引物设计中,颈环法同polyA加尾法有何区别?

    行使功能的microRNA成熟形式一般仅18——25nt,因此在逆转录环节通过特定引物增加其长度,以便于qPCR过程正常进行。颈环法中的逆转录引物由自身可形成颈环结构的通用序列加上目的microRNA 3’端碱基的反向互补序列;polyA加尾法即在逆转录前先加polyA尾,然后通过oligo(dT)引物进行逆转录。方法设计及实验成本均高于加尾法,但在检测灵敏度及特异性方面具有优势。

    Q:荧光定量PCR实验中无Ct值出现

    (1)反应的循环数不够:一般要在35个循环以上,但是过多的循环次数可增加背景值。

    (2)检测荧光信号的步骤有误:SYB-Rgreen法(SG法)采用的是72延伸时采集荧光信号,Taman法则是在退火结束或延伸结束时进行信号采集。

    (3)引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性,若是电泳条带呈弥散状,可考虑重新合成引物或探针。

    (4)模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。

    (5)模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

    (6)序列或者引物有误:检测样品中不含有待检测基因。

    Q:Ct值出现过晚(Ct>38)

    (1)扩增效率低: 优化反应条件;设计更好的引物或探针;改用三步法进行反应等。

    (2)模版降解或模版浓度太高。

    (3)试剂灵敏度不好:更换更高灵敏度、抗干扰的试剂。

    (4)检测基因结构复杂:高GC、复杂二级结构和长片段模版,都会影响PCR扩增。

    (5)扩增产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。

    Q:扩增效率低

    (1)引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。

    (2)反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。

    (3)反应条件不够优化:可调整退火温度或改为三步扩增法。

    (4)反应体系中有PCR反应抑制物:一般是加入模板时所引入,应先把模板适度稀释,再加入反应体系中,减少抑制物的影响。

    Q:溶解曲线不止一个主峰

    (1)引物设计不够优化:应避免引物二聚体和非特异性扩增出现。

    (2)同源性比较高:被检测基因在待检测样品有同源性较高的序列。

    (3)模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。

    Q:标准曲线线性关系不佳

    (1)加样/稀释误差: 使得标准品不呈梯度。

    (2)标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融,或重新制备并稀释标准品。

    (3)引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针。

    (4)模板中存在抑制物,或模板浓度过高

    Q:负对照有信号

    (1)引物设计不够优化:应避免引物二聚体和发夹结构的出现。

    (2)模板有基因组的污染:RNA提取过程中避免基因组DNA的引入,或通过引物设计避免非特异扩增。

    (3)实验器材污染:移液器、水、枪头或者荧光定量PCR孔内有荧光污染。

    Q:如何提高实验反应的灵敏度与特异性?

    (1)确定模板RNA完整性,无DNA污染。

    (2)RNA模板中不应含有扩增反应的抑制剂。

    (3)为了防止模板降解,在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。

    (4)使用适量的模板RNA,模板量太多会降低特异性,太少会导致扩增不出条带或条带太弱。

    (5)若模板中有二级结构,可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。

    (6)设计引物时,避免在引物3’端含有互补序列,避免形成内部发卡结构。

    Q:避免RNA降解的方法有哪些?

    (1)在用来验证完整性之前先在变性胶上分析RNA。

    (2)运用良好无污染的技术分离RNA

    (3)将组织提取后立刻提取RNA,并将提取好的RNA反转录为cDNA进行低温保存。

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